ERGEBNISSE

Hinweise:

PMT-Spannung:
Wir haben für die Analyse am Flow unsere Standardeinstellungen benützt. In der Aufbereitung gibt es aber einen kleinen Unterschied: normalerweise resuspendieren wir am Schluss mit PBS-Paraformaldehyd nicht mit PBS-BSA. Auch das Lysereagenz hat einen Einfluss. Sie sehen das bei den negativen Lymphopopulationen, die nicht optimal innerhalb der ersten Dekade liegen. Mit Optilyse, Resuspension in Paraformaldehyd wird die Negativkontrolle gleich etwas anders.  Man hätte also für die Ansätze mit Ammoniumchloridlyse ohne Paraformaldehydresuspension die PMTs noch etwas erhöhen können. Spielt aber für den Vergleich verschiedener Antikörper keine Rolle daher haben wir unsere Standardeinstellungen verwendet.

Zelldefinitionen:
NE: Neutrophile Granulozyten, definiert durch: nach CD16 (stark), FSC und SSC
LY: Lymphozyten, definiert durch: FSC, SSC, CD45 (stark), CD14 (neg)
MO: Monozyten, definiert durch: CD14, FSC, SSC, CD45: diese Population enthält nur die CD14 starken Monos
EO: Eosinophile Granulozyten, definiert durch: FSC, SSC, CD16 (schwach), CD45
BA: Basophile Granulozyten, definiert durch: FSC, SSC, CD45, HLA-DR (negativ), CD2 (negativ), CD16 (negativ), CD14 (negativ)

Für die PE Antikörper mussten wir auf CD16 verzichten. Wir haben stattdessen CD10 verwendet, was aber kein optimaler Ersatz für die Abtrennung der Eos war.

Reinheit:
Die Populationen sind durch den Einsatz der Antikörpergemische relativ sauber, eine 100%ige Reinheit kann es aber nicht geben.

Doubletten:
Bei manchen Antikörpern, besonders bei CD8 FITC, wird ein lange bekanntes Phänomen deutlich, das Escapee-Phänomen. Lymphozyten lagern sich an Neutrophile Granulozyten an. Das ergibt dann große, Side-Scatter-starke Zellen mit ungewöhnlichem Färbeverhalten. Analysiert man nur das Scatter-Lymphogate, dann flüchten die CD8-positiven Zellen dadurch gewissermaßen aus diesem Gate, daher der Name Escapee-Phänomen.

Carry Over (Verschleppung)
Wir haben meist mit dem FACS-Loader (=Autosampler) analysiert und um die 50000 Zellen gesammelt. Da können Verschleppungen von nur 0.01% schon auffallen (5 Dots in den Dot-Plots). Und Flow-zytometer haben durchaus Verschleppungen dieses und größeren Ausmaßes. Meist sieht man das bei den Neutrophilen. Wir haben das manchmal in den PDF-Files kommentiert, manchmal nicht. Lassen Sie sich also von einzelnen unglaublichen Dots nicht irritieren. Ignorieren Sie aber nicht alle kleinen Populationen: 20 Dots bei den Neutrophilen können leicht eine Verschleppung sein, 20 Dots bei den Basophilen kaum.

Kein Wettkampf um die stärkste Färbung
Ich möchte die Antikörpertestung nicht als Wettkampf der verschiedenen Antikörper sondern als Information über die Antikörper verstehen.
- Stärker färbende Antikörper müssen nicht automatisch besser für eine bestimmte Anwendung sein. Als Beispiel möchte ich eines unserer früheren Projekte erwähnen: Baso-Zählung mit CD45/SSC. Der stärkere CD45 Antikörper ergab eine schlechtere Trennung der Basos von den Lymphozyten als der schwächere.
- Stärker färbende Antikörper müssen nicht automatisch stärker verdünnbar sein. Denn zum Erreichen der Sättigung kommt es nicht auf die starke Anfärbung sondern die Antikörpermenge an.

Warum keine Zahlenangaben
Wir hatten ursprünglich vor, auch MFI Angaben mitzuliefern. Da unsere Analysen aber keine Mittelwerte von Normalpopulationen sondern Einzelproben sind, ist ein exakter Vergleich verschiedener Antikörper, wie Zahlen ihn vortäuschen würden, ohnehin nicht möglich.  

Wie kommt man zu vergleichbaren Ergebnissen
Wir haben einige Zeit überlegt, wie man eine gewisse Vergleichbarkeit mit minimalem Aufwand erreicht. Fast jeder hat CD4 FITC von BD, meist im IMK oder IMKplus KIT. Wir haben daher 5 unauffällige Proben mit CD4-FITC / CD8-PE aus dem Kit angesetzt (45 PERCP wurde dazugesetzt) und analysiert. 5 Werte sind natürlich nicht viel, es gab aber keine großen Unterschiede unter den 5 Proben. Wenn Sie wissen, wie der CD4er in FITC und der CD8er in PE von BD bei normalen Proben bei Ihnen kommt, können Sie in etwa einschätzen, wie die anderen dargestellten Antikörper bei Ihnen aussehen würden.
Wenn Sie diese Antikörper nicht haben: Irgendeinen der dargestellten Antikörper werden Sie vielleicht haben und haben damit einen groben Anhaltspunkt bezüglich der Vergleichbarkeit mit Ihren Ergebnissen.

Für den PERCP-Vergleich haben wir uns für die Darstellung von CD3 entschieden.