Die Polymerase Chain Reaction (PCR, Polymerase Kettenreaktion) bezeichnet eine Technik, bei der von bestimmten Abschnitten der DNA (Desoxyribonukleinsäure = die Erbinformation tragenden Ketten in den Chromosomen) eine Vielzahl von Kopien angefertigt wird. Diese Technik kann man zum Nachweis von Infektionserregern (z.B. Bakterien, Viren), zur Erkennung von Erbkrankheiten aber auch zum Nachweis der Vaterschaft oder Täterschaft ("genetischer Fingerabdruck") verwenden.

Jede Zelle muss, um sich zu vermehren, eine Kopie von ihrer eigenen DNA anfertigen können. Jede Zelle hat also die notwendigen Mittel zur Vervielfältigung von DNA in sich. Bei der PCR macht man sich diese Mittel zunutze und läßt viele DNA-Verdopplungsschritte hintereinander ablaufen. Man erhält so 2, 4, 8, 16, 32, ... u.s.w. Kopien. Nach 20 Schritten also theoretisch etwa 1 Million Kopien. Doch ganz so einfach ist der Vorgang natürlich nicht.

Als Beispiel möchte man aus dem abgebildeten DNA Doppelstrang eines bestimmten Bakteriums den Abschnitt zwischen den grauen Linien vervielfältigen:

Dazu muss man unbedingt die genaue Zusammensetzung der flankierenden Abschnitte kennen. Diese Abschnitte sind im folgenden Bild grün bzw. blau gekennzeichnet:

Den anderen, violetten DNA-Abschnitt zwischen den beiden grauen Strichen braucht man nicht zu kennen, nur die zwei Flankenregionen.

Kennt man diese 2 Abschnitte, dann müssen zu diesen Abschnitten genau passende Gegenstücke hergestellt werden. Man nennt diese Gegenstücke auch Primer. Diese muss man nicht selber herstellen, für die gängigsten Analysen sind sie fertig erhältlich.

Will man mit der PCR z.B. bestimmte Bakterien nachweisen, muss sichergestellt werden, dass diese Primer ausschließlich mit der DNA dieser Bakterien reagieren.

Hat man jetzt Primer zur Verfügung kann die eigentliche PCR beginnen:

DER PCR ZYKLUS - DIE VERVIELFÄLTIGUNG DER DNA

1. Die Denaturierung (Denaturation)

Der Name trägt wenig zum Verständnis bei. In dieser Phase wird durch Einwirken einer hohen Temperatur (94°C) der DNA Doppelstrang in die zwei Einzelstränge aufgetrennt.

Erst dadurch können die Primer an die passenden DNA-Abschnitte binden.

2. Das Annealing

Anneal heißt eigentlich härten, oder Glas aushärten lassen. Bei der PCR bezeichnet man damit den bei 54°C durchgeführten Schritt des Anlagerns der Primer an die entsprechenden DNA-Abschnitte der beiden DNA-Einzelstränge.

Realistischer betrachtet muss man sich das natürlich etwas anders vorstellen: Im Reaktionsgefäß schwimmen eine Menge Primerstücke und eine Menge Einzelstrang-DNA-Stücke. Die Primer binden sich immer wieder an irgendeiner Stelle an die DNA, aber diese Verbindungen lösen sich auch rasch wieder. Trifft der Primer aber auf seinen passenden DNA-Abschnitt, dann hält diese Verbindung länger.

Beim Abkühlen in der Annealingphase muss man dafür sorgen, dass die Primerstücke im Überschuss vorhanden sind, sonst würden sich die DNA-Einzelstränge wieder aneinander binden.

3. Extensionsphase

Jetzt kommt die Polymerase ins Spiel. Sie ist ein Enzym, das die Bildung neuer DNA-Stränge, die die genauen Gegenstücke der alten DNA-Abschnitte sind, ermöglicht. Dieser Schritt findet bei 72°C statt.

Die neu hergestellten Abschnitte sind orange dargestellt.

Jetzt ist ein PCR-Zyklus beendet und man hat in unserem Beispiel 4 DNA Einzelstränge des interessierenden Abschnittes: 2 neu synthetisierte (orange) und 2 originale (violett). Man hat also eine Verdopplung erreicht.

Ein PCR-Zyklus dauert nur einige Minuten und kann automatisch in einem entsprechend programmierten Gerät ablaufen (sogenannte Thermocycler).

Im nächsten Zyklus, der wieder mit der Deanaturierung beginnt, werden sich die Primer wieder an die originalen DNA-Stränge aber auch an die neu synthetisierten binden und am Ende des 2 Zyklus hat man dann 8 DNA-Stränge. Führt man mehrere Zyklen durch kommt man rasch auf eine Million oder mehr Kopien des ursprünglichen DNA-Abschnitts.

Thermocycler der Firma Eppendorf. In Thermocyclern können PCR-Zyklen automatisch ablaufen.

NACH DER VERVIELFÄLTIGUNG

Was macht man jetzt mit der vervielfältigten DNA? Das hängt ganz von der Anwendung ab:

a) Nachweis von Infektionserregern

Sehr einfach gestaltet sich die Weiterbearbeitung, wenn man in der PCR Reaktion die DNA von Bakterien oder Viren vervielfältigt hat. Man färbt die DNA mit einer relativ einfachen, automatisierten Färbereaktion und braucht dann nur feststellen, ob sich überhaupt DNA gebildet hat, was dafür spricht, dass der Erreger in der Probe enthalten war, oder ob sich keine DNA gebildet hat, was dafür spricht, dass der Erreger nicht in der Probe vorhanden war.
Diese Methoden sind heute schon soweit automatisiert, dass z.B. der hochempfindliche Nachweis von Tuberkulose-Bakterien in jedem Routinelabor auf einfache Weise in hoher Qualität durchgeführt werden kann.

b) Genetischer Fingerabdruck, Forschungsanwendungen

Wesentlich komplizierter gestaltet sich die Weiterverarbeitung der vervielfältigten DNA für andere Anwendungen. So müssen z.B. für den genetischen Fingerabdruck die vervielfältigten DNA Stücke mit speziellen Enzymen zerschnitten, auf einem Trennungsgel aufgetrennt und die einzelnen Banden anschließend sichtbar gemacht werden. Das Muster der Banden ergibt dann den genetischen Fingerabdruck.

Links sehen sie Auftrennungen von DNA, die mittels PCR vervielfältigt wurde. In der Spalte T die DNA des Tatverdächtigen, in der Spalte S die DNA der Spur, die man am Tatort gefunden hat. Die aufgetrennten Banden (rote Pfeile) stimmen überein. In der Spalte O ist die DNA des Opfers aufgetrennt, in der Spalte K eine Kontrolle. In den Spalten M sind Standards aus DNA Stücken unterschiedlicher Größe aufgetragen. Das schöne leiterartige Verteilungsmuster in den M-Spalten zeigt, dass die Auftrennung funktioniert hat.